双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp）,结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究。     

牦牛源溶血致病性表皮葡萄球菌的分离鉴定及药敏分析

对1株分离自西藏那曲地区养殖场有出血性症状牦牛的致病性菌进行分子鉴定及药敏分析,为西藏地区牦牛出血性疾病提供治疗依据。通过对病死牦牛肺脏、肝脏进行细菌分离纯化获得疑似菌株,对所得疑似菌株进行形态学观察与哥伦比亚血平板试验筛选出疑似致病菌株,再对疑似致病菌株进行生理生化鉴定试验、16S rDNA通用引物检测及测序、同源性比对,后经药敏试验得到该疑似致病菌株的敏感药物,最后通过动物回归试验验证其敏感药物的治疗效果。结果表明,通过对病死牦牛肺脏、肝脏分离纯化获得6株疑似菌株,经形态学观察试验、哥伦比亚血平板试验筛选出1株具有溶血性的革兰氏阳性球菌S-4。经生理生化鉴定试验、16S rDNA测序、同源性比对,鉴定S-4菌株为表皮葡萄球菌;药敏试验结果显示,S-4菌株对恩诺沙星、新霉素、多黏菌素B、卡那霉素、环丙沙星敏感,对氟苯尼考、多西环素中介敏感,对链霉素、红霉素、四环素、青霉素、头孢氨苄耐受;动物回归试验显示,该菌株具有致病性,且恩诺沙星、新霉素、卡那霉素3种药物治疗效果良好,多黏菌素B、环丙沙星治疗效果差。本试验获得1株具有致病性的牦牛源表皮葡萄球菌,该致病菌在养殖过程中可使用恩诺沙星、新霉素、卡那霉素3种药物进行治疗。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni²⁺柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。     

烯丙孕素-β-环糊精水溶性衍生物包合物的制备及表征

为了提高难溶性药物烯丙孕素（altrenogest,ALT）的水溶性,本试验采用冷冻干燥法来制备烯丙孕素-羟丙基-β-环糊精（ALT-HP-β-CD）及其衍生物2,6-二甲基-β-环糊精（DIME-β-CD）包合物载药体系,并对ALT的线性关系和专属性、仪器的精密度以及包合物的回收率和稳定性进行了测定。以包合物的收率和包合物中ALT的包合率为评价指标,采用正交试验设计优选2种包合物的最佳制备条件,并使用傅里叶变换红外光谱法、热重分析法和显微镜成像法对所制得的ALT包合物进行表征分析,采用溶解度法测定包合物中ALT的溶解度。结果表明,ALT在1~12 μg/mL范围内具有较好的线性关系且专属性良好,仪器的精密度良好;加入0.1、0.2和0.3 mL ALT标准液的ALT-HP-β-CD包合物的平均回收率分别为97.78%、99.38%和99.90%,加入0.1、0.2和0.3 mL ALT标准液的ALT-DIME-β-CD包合物的平均回收率分别为93.86%、97.72%和94.93%;ALT-HP-β-CD包合物的最佳制备工艺为在55 ℃条件下,ALT与HP-β-CD的投料摩尔比为1∶7,包合时间为4 h,溶液pH为8,溶剂水的加入量为110 mL/g药物;ALT-DIME-β-CD包合物的最佳制备工艺为在55 ℃条件下,ALT与DIME-β-CD的投料摩尔比为1∶4,包合时间为4 h,溶液pH为9,溶剂水的加入量为100 mL/g;经傅里叶变换红外光谱法、热重分析法和显微镜成像法表征,证实成功制得包合物;溶解度试验得出包合物的溶解度分别约为ALT原药的1 012和1 354倍,表明两种包合物均可有效增加ALT的溶解度。本试验包合物的制备方法简单,条件温和,易于产业化生产。     

哺乳动物卵母细胞非整倍体产生机制的研究进展

雌性生殖细胞进行减数分裂时易发生染色体分离错误而产生非整倍体卵母细胞,其受精后会产生非整倍体胚胎,导致出生缺陷或胚胎致死,是影响哺乳动物繁殖的重要因素。卵母细胞在第一次减数分裂前期发生同源染色体联会,此时DNA双链断裂引发重组。重组时缺乏交叉、重组事件数量的减少及交叉靠近端粒或着丝粒导致染色体发生同向分离或不分离,从而产生非整倍体卵母细胞。减数分裂期间,当染色体的端粒共向于同一极或没有完全附着在纺锤体微管上时,纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint,SAC）被激活,E3泛素连接酶APC/Cyclome （APC/C）沉默,保护分离酶抑制蛋白（securin）和细胞周期蛋白B （cyclin B）不被降解,从而抑制分离酶和染色体的分离。直到所有染色体与纺锤体实现稳定的双极定向并正确排列到赤道板上,SAC关闭,染色体正确分离。卵母细胞中SAC蛋白缺失,导致SAC不能有效地监测端粒在纺锤体上的正确附着,发生染色体分离错误,从而产生非整倍体卵母细胞。因此,通过现代分子技术手段解析非整倍体卵母细胞所涉及的机制是保护哺乳动物生育的重要目标。作者主要介绍了卵母细胞减数分裂的特点,详细阐述了卵母细胞非整倍体发生的染色体分离错误的分子机制,以期为开发卵母细胞非整倍体的治疗手段提供参考。     

东佛里生羊MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在研究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因多态性及其对东佛里生羊生长性状的影响。从324只东佛里生羊全血中提取DNA,对MSTN基因外显子序列和非翻译区(untranslated region,UTR)序列进行PCR扩增,采用一代测序技术鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分析不同位点的遗传多态性,并将不同基因型与东佛里生羊的生长性状进行关联分析。结果显示,在东佛里生羊MSTN基因外显子中未检测到突变;在3'-UTR区的272 bp处存在G→A单碱基突变,该位点只检测到AG和AA基因型,且AA基因型频率高于AG基因型;在5'-UTR区的176 bp处存在C→A突变,该位点只检测到CC和AC基因型,且CC基因型频率高于AC基因型。遗传多样性参数分析结果表明,东佛里生羊群体MSTN基因3'-UTR-272和5'-UTR-176位点的纯合度分别为0.827和0.887,杂合度分别为0.173和0.113,2个位点的多态性均较低(PIC<0.25),其群体基因型分布均符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)。关联分析发现,3'-UTR-272位点AG基因型体斜长显著高于AA基因型(P<0.05),5'-UTR-176位点CC基因型胸围显著高于AC基因型(P<0.05),其余指标均无显著差异(P>0.05)。综上,东佛里生羊MSTN基因3'-UTR和5'-UTR突变位点可作为其目标性状选育的分子标记。     

lncRNA作为竞争性内源分子的作用机制及研究进展

竞争性内源RNA （competing endogenous RNA,ceRNA）假说提出具有相同短序列非编码微小（microRNA,miRNA）应答元件（microRNA response element,MRE）的转录物通过竞争的方式结合miRNA,从而影响转录物的表达水平。ceRNA假说颠覆了miRNA与靶基因单向调控的传统观念,在RNA调控网络中具有重要的生物学意义。在众多转录物中,长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）是一类序列长度超过200个核苷酸的非编码RNA,对lncRNA的研究涉及到遗传、分子生物、基因调控、疾病（癌症、神经系统疾病等）等领域。miRNA与lncRNA形成了一个相互作用的调控网络,lncRNA可作为ceRNA抑制miRNA的功能,从而影响后续基因的表达。近年来,随着生物信息学技术的发展,科研人员发现ceRNA作用机制不仅涉及到人类癌症疾病,而且在各种复杂动物的肌细胞分化、脂肪细胞分化和颗粒细胞凋亡等生物过程中也发挥重要的调控作用。作者追溯了ceRNA调控机制,分析了ceRNA网络调控的影响因素,综述了ceRNA在不同动物中调控miRNA的研究进展,为进一步研究lncRNA与miRNA的调控网络提供参考,为畜牧业发展及复杂动物疾病治疗提供新的思路。     

哺乳期放养云岭山羊羔羊生长曲线拟合分析

[目的]探讨放养云岭山羊羔羊在哺乳期的生长发育规律。[方法]选取待产母羊24只,共产羔36只（公羔17只,母羔19只）,测定0~8周龄羔羊的体重（每周测定1次）和体尺（隔1周测定）。采用Logistic、Gompertz和Von Bertalanffy 3种非线性模型对0~8周龄公羔、母羔的体重进行生长曲线拟合,并对初生体重以及试验末体重进行相关性分析。[结果]采用的3种非线性模型均能够很好地拟合哺乳期云岭山羊羔羊生长曲线,拟合度均大于0.99。Gompertz和Von Bertalanffy模型拟合效果较优,公羔的生长发育曲线拐点时间分别为3.212周和2.862周,拐点体重分别为5.691、5.352 kg;母羔拐点时间分别为1.927周和1.325周,拐点体重分别为4.532、3.960 kg;公、母羔之间拐点周龄和拐点体重存在差异,公羔平均在3.037周龄体重增长速度达到最大,而母羔平均在1.626周龄体重增长速度达到最大。初生重对羔羊试验末体重有极显著（P<0.01）影响。[结论]该研究结果可为今后对哺乳期放养云岭山羊羔羊进行合理补饲提供依据。     

不同部位西门塔尔牛肉理化品质分析及烤制加工适宜性的研究

[目的]研究不同部位西门塔尔牛肉原料肉的理化品质,评价烤制加工后的食用品质和感官品质。[方法]选取体重为550 kg左右的西门塔尔肉牛10头,屠宰分割后取不同部位牛肉（里脊、外脊、前腿、后腿、眼肉、米龙）。4 ℃排酸72 h后,采用常规方法测定不同部位牛肉的蛋白质含量、脂肪含量、水分含量、pH值以及色泽指标,并对大理石花纹等级进行评分;220 ℃烤制10 min后,对不同部位牛肉进行剪切力和加工损失率测定,并对感官品质指标进行评价。[结果]不同部位牛肉的脂肪含量、大理石花纹评分、L^*值、a^*值、剪切力、色泽评分、嫩度评分、多汁性评分、香气评分和总体可接受性评分差异显著（P<0.05或P<0.01）,不同部位牛肉中的蛋白质含量、水分含量、pH值、b^*值、加工损失率、滋味评分差异不显著（P>0.05）。眼肉中脂肪含量最高（P<0.01）,前腿、后腿脂肪含量相同,均为最低（P<0.01）;眼肉、外脊的大理石花纹评分显著（P<0.01）高于其他部位;眼肉、外脊的L^*值显著（P<0.05）高于其他部位,里脊、后腿的L^*值显著（P<0.05）低于其他部位;外脊和眼肉的a^*值显著（P<0.01）低于其他部位;眼肉、外脊的剪切力显著（P<0.01）低于其他部位;眼肉的总体可接受性评分显著（P<0.05）高于其他部位,前腿、后腿和米龙的总体可接受性评分相同,均为最低（P<0.05）。[结论]外脊、眼肉的肌内脂肪含量高于其他部位,烤制后产品的嫩度、滋味及总体可接受性较好。眼肉和外脊是西门塔尔牛肉中最适宜加工烤制产品的部位。     

德州驴生产性能的初步研究

德州驴是优秀的皮肉兼用驴,包括“三粉驴”和“乌头驴”两个品系,但是关于德州驴的研究较少。为了向驴产业提供可靠的德州驴生产性能数据,该研究以40头三粉驴和9头乌头驴为研究对象,系统研究了德州驴的体尺性状、屠宰性能、脏器系数及胸腰椎数等性状特点。结果表明,三粉驴的屠宰率为54.02%,净肉率为42.43%,净皮率为8.12%;乌头驴的屠宰率为53.71%,净肉率为40.32%,净皮率为9.41%。表明三粉驴更适合于向肉用驴品系进行培育,乌头驴更适合于向皮用驴品系进行培育。与乌头驴相比,三粉驴的肝脏系数较高,并且小肠、盲肠显著较长(P<0.01),说明三粉驴具有更加优良的消化及代谢能力,可能是其具有更优异产肉性能的原因之一。调查发现,德州驴群体内存在胸腰椎数的变异,胸椎数为17~19个,腰椎数为5~6个;胸椎数与腰椎数存在不同形式的组合,18胸椎5腰椎占比为73.47%,18胸椎6腰椎占比为12.24%,19胸椎5腰椎占比为2.04%,17胸椎6腰椎占比为12.24%。统计发现,多一个胸椎或者腰椎可使驴皮产量增加。该试验结果可为德州驴产业健康可持续发展提供重要理论支撑,为品种及新品系培育提供数据支持。